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PCR试剂盒实验的注意事项

发布时间:2022-06-30    点击次数:366

  PCR试剂盒实验的注意事项


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  PCR实验要注意以下几点:

  1. PCR引物设计:

  引物设计可能是PCR扩增成功zui关键的因素。如引物设计欠佳,可能导致扩增产物不足,甚至扩增失败,其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体,此又成为PCR反应的竞争性产物,从而进一步抑制PCR产物形成。

  在引物设计时必须考虑以下几个因素,其中zui重要的是引物长度、溶解温度(Tm)、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。

  (1)引物长度:由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联,因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。

  (2)溶解温度(Tm):因加热而断开H键,使双链DNA分开或“溶解"为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算:Tm=2(A+T) + 4(G+C)。

  需注意PCR反应至少有两个(一对)引物,两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近,不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配,而引物Tm值较低,反应温度较高时则可能不能发生作用,因此如引物的Tm值差异较大,可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。

  (3)引物序列互补:设计引物时应没有3个碱基以上的内引物配对,如引物有这样具有自我配对的区域,“弹回"即部分双链结构将发生在退火反应时。

  (4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸:待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布,G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45%-55%。在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸,因其可促进非特异性退火,多A 和多T延伸也应避免,因其可“呼吸"和使引物-模板复合物展开延伸,降低扩增的效率。同时多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也应被避免。

  (5)3’-末端序列:为控制引物错配,应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。

  总而言之,应重视PCR引物设计,设计PCR引物时应认真小心。对于一个成功的PCR来说,几个重要因素如引物长度、GC含量和3’序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50%、长度约为20个碱基,因此能使Tm值处于56-62ºC范围。分析靶基因潜在引物位点时,应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向,不自我互补,与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计,节省时间,减少错误,可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。

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