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多色免疫荧光染色试剂盒使用说明

发布时间:2022-08-29    点击次数:172

  多色免疫荧光染色试剂盒使用说明


  酪酰胺信号放大(TSA,Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法,类似常规免疫组化的DAB显色方法 ,TSA技术同样采用HRP标记的二抗,同样有对应的“显色"步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物,产生活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合,使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物,重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育,换另一种酪胺荧光素底物,如此往复就可实现多重标记。

  TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点),产生大量的酶促产物,该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合,这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积,结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说,用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素),来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化,跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联,使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理,前一轮非共价结合的抗体被洗掉,共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育,周而复始。等到所有抗体孵育结束,荧光素都结合好后,最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育,因此无需担心抗体交叉反应,以及一抗二抗种属匹配问题,大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说,如果用TSA技术,同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验,而且信号放大的倍数大大增强。茹创生物开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种:TYR-480,TYR-520,TYR-570,TYR-620,TYR-690,TYR-780。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能,丰富了此试剂盒的内涵。

  多色免疫荧光染色试剂盒使用说明 试剂盒组成:

  产品名称规格保 存备注

  TYR-520荧光染料(绿光)(即用型)5mL-20℃TYR-520荧光染料 、TYR-570荧光染料 、TYR-690荧光染料 在-20度下 ,均为固体,使用之前需解冻。

  TYR-570荧光染料(红光)(即用型)5mL-20℃

  TYR-690荧光染料(即用型)5mL-20℃

  TSA+增强剂100ul-20℃(可选)

  高敏多聚hrp山羊抗兔二抗5mL4℃

  TSA+增强剂使用方法:TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号5-10倍,TSA+增强剂:TYR荧光放大液=1:500,使用TSA+增强剂不是必须的选项,可以根据具体的情况选择添加或者不选择添加。

  多色免疫荧光染色试剂盒使用说明操作流程:

  1、 石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲benⅠ15min-二甲benⅡ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ。取出放在通风厨内,酒精晾干后放入自来水中稍洗,蒸馏水洗。

  2、 抗原修复:组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法)。中火8min,停火8min,转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定)。

  3、 阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育15 min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

  4、 BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加用3%BSA-PBS(或者其他封闭液)均匀覆盖组织,室温封闭30min。

  5、 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X,切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

  6、 加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织,避光室温孵育50min,PBS洗三次。

  7、 荧光染料反应:TYRXXX荧光染料反应10-15min,PBS洗三次。

  8、 重复2-7步骤(换用另外一种TYRXXX荧光染料)

  9、 DAPI复染细胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。

  10、 封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

  11、 镜检拍照:切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

  染料激发波长发射波长

  DAPI 蓝色350420

  TYR-480450480

  TYR-520绿色490520

  TYR-570红色550570

  TYR-620590620

  TYR-690630690

  TYR-780750780

  文章引用试剂盒/方法:Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit (Guduo Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.


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