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植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)组成及操作步骤

发布时间:2022-09-02    点击次数:433


  植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)组成及操作步骤

  实验原理

  本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。 用纯化的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包 被单抗的微孔中依次加入植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO),再与 HRP 标记的 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过*洗 涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终 的黄色。颜色的深浅和样品中的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相关。用酶 标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中植物 1,5-二磷酸核酮 糖羧化酶(RubisCO)浓度。

  试剂盒组成:

  1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶

  7 终止液 6ml×1 瓶 2 酶标试剂 6ml×1 瓶

  8 标准品(300ng/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶标包被板 12 孔×8 条

  9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 4 样品稀释液 6ml×1 瓶

  10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml×1 瓶

  11 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml×1/瓶

  12 密封袋 1 个

  植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)组成及操作步骤 标本要求

  1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融

  2.不能检测含 NaN3 的样品,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

  操作步骤

  1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。

  150ng/L

  5 号标准品

  150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液

  75ng/L

  4 号标准品

  150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

  37.5ng/L

  3 号标准品

  150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

  18.75 ng/L

  2 号标准品

  150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

  9.375 ng/L

  1 号标准品

  150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50μl,待测样品孔中先加样品稀释液 40μl, 然后再加待测样品 10μl(样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽 量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

  3. 温育:用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

  4. 配液:将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用

  5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此 重复 5 次,拍干。

  6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50μl,空白孔除外。

  7. 温育:操作同 3。

  8. 洗涤:操作同 5。

  9. 显色:每孔先加入显色剂 A50μl,再加入显色剂 B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色

  10 分钟.

  10. 终止:每孔加终止液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

  11. 测定:以空白孔调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。


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