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天津本生解答:DNA提取方法的总结

发布时间:2022-11-17    点击次数:265

 

  天津本生解答:DNA提取方法的总结

 

  细菌DNA的提取:

  (一)

  试剂:

  1. 抽提缓冲液

  2% CTAB (W/V)

  2% PVP K25 (w/v) (去色素)

  100mM Tris-HCl (pH8.0)

  25mM EDTA (pH8.0)

  2.0M NaCl

  2.10M LiCl

  3. 2M LiCl

  4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)

  5. 3M NaAc (pH5.2)

  6. 96% 乙醇

  7. 70% 乙醇

  细菌DNA的步骤:

  1.抽提缓冲液65℃预热;

  2. 加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10min;

  3. 加酚/LV仿/ywc(25:24:1),振荡,离心12,000rpm,10min;

  4.取上清,加LV/ywc(24:1)振荡,离心12,000rpm,10min;

  5. 取上清,重复4步骤;

  6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的ybc),-20C沉淀;

  11. 离心12,000rpm,10min;

  12. 弃上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。

  (二)(我们常用的方法,但是有时有些细菌特别不好提,就用上面的方法)

  1. 将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。

  2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

  3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.

  4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀,再加入80ul CTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。

  5. 加入等体积的酚/LV/ywc混匀,离心4-5min, 将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的ybc,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。

  6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇.

  真菌DNA的提取:

  (一)

  1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

  2.加入4mL提取液,快速振荡混匀

  3.加入等体积的4mL的LV:ywc(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)

  4.1000rpm,4℃,5min

  5.上清用体积的LV:ywc(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃离心5 min)

  6.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷ybc或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

  7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 ulTE中

  8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr

  9.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)

  10.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

  11.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存备用

  DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,

  3M NaAc

  细菌DNA的细菌(二)

  1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

  2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次

  3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min

  4.等体积的LV仿:ywc(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)

  5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷ybc, 混匀, 静置约30 min

  6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 L TE中

  7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr

  8.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)

  9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

  10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。

 

  注:仅供参考!

 

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