天津本生解答：DNA提取方法的总结

　　天津本生解答：DNA提取方法的总结

　　细菌DNA的提取：

　　(一)

　　试剂：

　　1. 抽提缓冲液

　　2% CTAB (W/V)

　　2% PVP K25 (w/v) (去色素)

　　100mM Tris-HCl (pH8.0)

　　25mM EDTA (pH8.0)

　　2.0M NaCl

　　2.10M LiCl

　　3. 2M LiCl

　　4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)

　　5. 3M NaAc (pH5.2)

　　6. 96% 乙醇

　　7. 70% 乙醇

　　细菌DNA的步骤：

　　1.抽提缓冲液65℃预热;

　　2. 加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀，65℃，10min;

　　3. 加酚/LV仿/ywc(25：24：1)，振荡，离心12,000rpm，10min;

　　4.取上清，加LV/ywc(24：1)振荡，离心12,000rpm，10min;

　　5. 取上清，重复4步骤;

　　6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的ybc)，-20C沉淀;

　　11. 离心12,000rpm，10min;

　　12. 弃上清，70%乙醇洗，也可以再用100%乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。

　　(二)(我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法)

　　1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

　　2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

　　3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

　　4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

　　5. 加入等体积的酚/LV/ywc混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的ybc，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

　　6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇.

　　真菌DNA的提取：

　　(一)

　　1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

　　2.加入4mL提取液，快速振荡混匀

　　3.加入等体积的4mL的LV:ywc(24:1)，涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟!)

　　4.1000rpm，4℃，5min

　　5.上清用体积的LV:ywc(24:1)再抽提一次(10,000 rpm，4℃离心5 min)

　　6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷ybc或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

　　7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ulTE中

　　8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL)，37℃处理1 hr

　　9.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm，4℃离心5 min)

　　10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

　　11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用

　　DNA提取液：0.2M Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，0.01M EDTA，1%SDS，

　　3M NaAc

　　细菌DNA的细菌(二)

　　1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

　　2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次

　　3.加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min

　　4.等体积的LV仿:ywc(24:1)抽提1次(10,000 rpm，4℃离心5 min)

　　5.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷ybc, 混匀, 静置约30 min

　　6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中

　　7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL)，37℃处理1 hr

　　8.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm，4℃离心5 min)

　　9.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

　　10.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。

　　注：仅供参考!