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ELISA实验要点:实验结果不理想不容忽视的几点

更新时间:2023-04-11    点击次数:1701

  ELISA实验要点:实验结果不理想不容忽视的几点
 

  优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号,从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留,在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景,从而带来不理想的结果。

  在做ELISA实验时,洗板有两种方法:手工法洗板 和 洗板机洗板。二者没有本质的差别,只要操作合乎要求,均能得到正确、可靠的结果。

  手工洗板

  手工洗板人为因素比较大,实验人员必须经验丰富,洗涤次数要足够,冲击力又不要太大,加入的洗液量以说明书为准,防止孔口内有游离酶未能洗净,同时防止孔与孔之间液体交叉。洗涤结束后扣干亦非常重要,否则易造成假阳性。每次洗完板后,在吸水纸上轻轻拍干,拍板时要垂直,避免交叉感染。用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离;吸水纸要一次性使用,应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。酶结合物不耐干燥,特别在较高的温度下更易失活,所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间,时间越长,吸光度值越低。

  手工操作有 浸泡式 和 流水冲洗式 两种方法:

  浸泡式

  1. 吸干或甩干孔内反应液;

  2. 用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去);

  3. 浸泡,即将洗涤液注满板孔,放置1~2分钟,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;

  4. 吸干孔内液体。吸干应,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;

  5. 重复操作步骤3和4,洗涤3~4次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

  微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙xi载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。

  洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%~0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

  流水冲洗式

  流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置,使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗,持续冲洗2分钟后,吸干液体,再用蒸馏水浸泡2分钟,吸干即可。浸泡式犹如盆浴,流水冲洗式则好比淋浴,其洗涤效果更为,且也简便、快速。

  已有实验表明,流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压,让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳。

  洗板机洗板

  洗板机洗板人为因素少,速度快,条件恒定,但是使用洗板机洗板时应注意以下三个关键点。

  洗涤参数

  主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果你之前遭遇过高背景,那么不要犹豫,将洗涤量调为高,最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到,从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。

  天津本生ELISA试剂盒的使用手册中有列出洗涤量。我们建议使用350µl洗涤液进行洗涤,以便清洁整个反应孔的壁。一般来说,洗涤量越高,则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。

  洗涤次数

  影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然,洗涤次数越多,背景越低。然而,太多次的洗涤会降低信号强度,使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。不过,一般而言,包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少。对于用户包被的ELISA板,必须优化洗涤次数。

  控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说,96孔板的每个孔能容纳330至460 µl。不过,有些自动化洗板机可设置程序,分配远远超出这个量的洗涤液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其实很简单,就是在分液的同时打开吸液功能。换句话说,随着分液器分配更多的液体,抽吸器也将液体吸出。这种技术能增加洗涤量,但不会溢出到其他孔中。

  抽 吸

  还有一些参数会影响洗涤步骤的效果。这些参数包括吸液高度和吸入位置,这两者都能调整,以降低背景(残留量)和差异。

  残留液体中包含未结合的抗原或抗体,它们会增加背景信号。残留量越小,残留液体越少,转移到下一步的干扰液体也就越少。

  吸液高度会明显影响残留量;如果洗涤吸头与反应孔底部的距离稍大,那就会让残留量急剧增加。反之,如果洗涤吸头压着反应孔底部,那么也会使吸液效率降低,残留量增加。

  目前的洗板机一般使用两种类型的洗头:刚性和浮动。浮动洗头中的吸头可在洗涤过程中自由上下移动,而刚性洗头则固定在适当的位置。使用刚性洗头的洗涤操作在优化起来更为复杂,因为你需要非常仔细地调整吸液高度。如果你们实验室使用几种不同的板,那可能会很耗时。在使用浮动洗头时,吸头会降到反应孔的底部。调整高度就不是很重要,因此洗头会下降到底部。

  抽吸的位置也对残留量有着重要影响;如果每个孔只使用一个抽吸点(这很常见,因为更快),那么抽吸的位置需要优化。z佳的位置取决于洗头的性状,但它几乎不在反应孔的中间,即使这是所有洗头z常见的默认位置。一般来说,z佳位置在孔中间与孔壁之间的某处。

  反应孔的形状也会影响残留量。C形底(平底圆角)的微孔板一般会比那些平底尖角的微孔板残留量更低。

  洗板时应注意

  1. 需每天校正注液量及残液量,洗涤后残液量不得大于2 μl。

  2. 及时更换破损吸液针,避免破坏底板包被。

  3. 针对不同厂家酶标板注意调整吸液头下降高度,避免冲洗针头卡住酶标板。

  4. 注意调整洗液量,洗液量过多将溢出,过少将达不到洗涤效果。

  5. 关机前使用蒸馏水冲洗管道,避免洗液的结晶物堵塞管道。

  4. 不同种试剂盒的洗液严禁混合使用。

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