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本生阐述——ELISA试剂盒检测组织匀浆液有哪些注意事项

更新时间:2023-06-05    点击次数:1595

  本生阐述——ELISA试剂盒检测组织匀浆液有哪些注意事项


  介绍

  酶联免疫吸附测定(ELISA)作为最快速、灵敏、准确可靠的定量分析方法之一,组织样本的处理和数据的处理方式对于ELISA实验的成功有着非常重要的作用。ELISA检测的样本类型不仅包括常见的血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清,而且包括不常见的尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、精ye、阴道分泌物等。其中组织匀浆、细胞裂解液、粪便、精ye等样本的收集时间、处理方法和保存的差异,会造成获得样品间的蛋白含量差异较大,进而造成后续检测或数据处理上的一些问题,从而会影响到学者判断ELISA实验的结果。下面我们着重介绍一些比较通用的组织匀浆液的制备方法,并通过文献进行列举数据处理的方法,以供大家学习借鉴。

  玻璃匀浆器组织匀浆液的制备方法

  用4℃预冷的1×PBS(pH7.2-7.4,0.01M,cell culture)冲洗组织,去除残留血液,并去除组织上的筋膜、脂肪等冗余组织;

  称重后将组织用眼科剪刀和镊子剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:5-1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应5-9 mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,不建议反复冻融超过2次。因为过多的反复冻融可能影响细胞因子含量的稳定性。最后,将组织匀浆液于2-8℃,5000×g离心5-10分钟,取上清检测;

  处理样本的过程就是收集细胞因子或目标蛋白的过程,由于细胞因子或蛋白结构容易改变和降解,组织匀浆过程完成后,储存也非常重要,特别需要注意的是,不要反复冻融,样本处理之后可分装密封保存,4度保存应小于1周,-20 度不应超过3个月,-80度不应超过6个月。在标本使用前应室温缓慢均衡溶化,不能进行加热。

  超声组织匀浆液的制备方法

  提前将剪刀、镊子用75%酒精消毒,然后用预冷的1×PBS涤浸泡,用来剪切、剪碎组织;

  对应将要提取蛋白的组织编号,然后给EP管编号,放在冰上进行预冷。用预冷的PBS (0.01M,pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液,称重后将组织剪碎;

  配置裂解液:提前将蛋白酶抑制剂(货号:P6730)、磷酸酶抑制剂(货号:P1260)、PMSF(货号:P0100)分别按照1:100的体积比加入到RIRP裂解液中,快速摇匀后静置冰上即可;

  将剪碎的组织,加入对应体积的裂解液(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的裂解液,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录);

  在冰上,用剪刀将组织剪碎(剪至组织颗粒非常细小,甚至剪成糜状物),然后去超声破碎即可。(超声的条件:仪器:新芝 Scientz-IID;破碎条件:180W超声3s关6s,超声一次时间1min,超声3-4次);

  超声破碎完成后,离心(4℃,12000rpm离心30分钟);

  离心完成后,用移液器吸取上清液至新的EP管中,同时记录蛋白提取液的体积,然后用BCA法测上清蛋白的浓度。

  组织匀浆液的蛋白定量必要性

  为了避免假阳性的产生ELISA检测指标众多,某些组织样本如肝脏,肾脏,脑组织等,因为细胞内含有的蛋白复杂多变,可能会造成与检测指标有假阳性反应。所以通过蛋白含量检测,把高浓度(20mg/mL以上)的样本进行稀释至1-2mg/mL,进行判断是否存在假阳性的可能;

  为了方便后续的数据处理和比较分析

  因为组织块的大小、提取蛋白的效率不同,所以必然提取的组织匀浆液中蛋白含量在一定的范围内变化,或者样本间蛋白含量差异显著。这些都会造成后续数据处理的困难,无法分辨是因为研究处理的影响,还是蛋白含量造成的差异性。因此,大多数学者会继续发掘数据的其余方面,例如,处理组与对照组的含量百分比;每克组织匀浆蛋白中细胞因子含量的比较;联用其余指示性指标进行比较,例如,炎症反应级别、脂肪率、模型差异等进行联合比较分析。

  组织匀浆液进行细胞因子检测的思考

  因为目前检测细胞因子的类型越来越多,我们也要重新考虑样本处理适合自己的样本类型,并且适合自己检测的细胞因子类型,例如,检测因子有可能为蛋白酶3(Protease 3)、核糖核酸酶A(核糖核酸酶A)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE/ELA2)等具有酶活性质的细胞因子,在组织匀浆过程中是否添加蛋白酶抑制剂就值得思考;

  一些检测细胞因子需要酸化激活处理也需要特别注意,例如转化生长因子-β1(TGF-β1)、肌肉生长抑制素(GDF-8)等,因此在组织匀浆液的pH最好处于6.5-7.5的中性范围;

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