本生阐述——ELISA试剂盒检测组织匀浆液有哪些注意事项

　　本生阐述——ELISA试剂盒检测组织匀浆液有哪些注意事项

　　介绍

　　酶联免疫吸附测定(ELISA)作为最快速、灵敏、准确可靠的定量分析方法之一，组织样本的处理和数据的处理方式对于ELISA实验的成功有着非常重要的作用。ELISA检测的样本类型不仅包括常见的血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清，而且包括不常见的尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、精ye、阴道分泌物等。其中组织匀浆、细胞裂解液、粪便、精ye等样本的收集时间、处理方法和保存的差异，会造成获得样品间的蛋白含量差异较大，进而造成后续检测或数据处理上的一些问题，从而会影响到学者判断ELISA实验的结果。下面我们着重介绍一些比较通用的组织匀浆液的制备方法，并通过文献进行列举数据处理的方法，以供大家学习借鉴。

　　玻璃匀浆器组织匀浆液的制备方法

　　用4℃预冷的1×PBS(pH7.2-7.4，0.01M，cell culture)冲洗组织，去除残留血液，并去除组织上的筋膜、脂肪等冗余组织;

　　称重后将组织用眼科剪刀和镊子剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:5-1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应5-9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，不建议反复冻融超过2次。因为过多的反复冻融可能影响细胞因子含量的稳定性。最后，将组织匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10分钟，取上清检测;

　　处理样本的过程就是收集细胞因子或目标蛋白的过程，由于细胞因子或蛋白结构容易改变和降解，组织匀浆过程完成后，储存也非常重要，特别需要注意的是，不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4度保存应小于1周，-20 度不应超过3个月，-80度不应超过6个月。在标本使用前应室温缓慢均衡溶化，不能进行加热。

　　超声组织匀浆液的制备方法

　　提前将剪刀、镊子用75%酒精消毒，然后用预冷的1×PBS涤浸泡，用来剪切、剪碎组织;

　　对应将要提取蛋白的组织编号，然后给EP管编号，放在冰上进行预冷。用预冷的PBS (0.01M，pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎;

　　配置裂解液：提前将蛋白酶抑制剂(货号：P6730)、磷酸酶抑制剂(货号：P1260)、PMSF(货号：P0100)分别按照1:100的体积比加入到RIRP裂解液中，快速摇匀后静置冰上即可;

　　将剪碎的组织，加入对应体积的裂解液(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的裂解液，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录);

　　在冰上，用剪刀将组织剪碎(剪至组织颗粒非常细小，甚至剪成糜状物)，然后去超声破碎即可。(超声的条件：仪器：新芝 Scientz-IID;破碎条件：180W超声3s关6s，超声一次时间1min，超声3-4次);

　　超声破碎完成后，离心(4℃，12000rpm离心30分钟);

　　离心完成后，用移液器吸取上清液至新的EP管中，同时记录蛋白提取液的体积，然后用BCA法测上清蛋白的浓度。

　　组织匀浆液的蛋白定量必要性

　　为了避免假阳性的产生ELISA检测指标众多，某些组织样本如肝脏，肾脏，脑组织等，因为细胞内含有的蛋白复杂多变，可能会造成与检测指标有假阳性反应。所以通过蛋白含量检测，把高浓度(20mg/mL以上)的样本进行稀释至1-2mg/mL，进行判断是否存在假阳性的可能;

　　为了方便后续的数据处理和比较分析

　　因为组织块的大小、提取蛋白的效率不同，所以必然提取的组织匀浆液中蛋白含量在一定的范围内变化，或者样本间蛋白含量差异显著。这些都会造成后续数据处理的困难，无法分辨是因为研究处理的影响，还是蛋白含量造成的差异性。因此，大多数学者会继续发掘数据的其余方面，例如，处理组与对照组的含量百分比;每克组织匀浆蛋白中细胞因子含量的比较;联用其余指示性指标进行比较，例如，炎症反应级别、脂肪率、模型差异等进行联合比较分析。

　　组织匀浆液进行细胞因子检测的思考

　　因为目前检测细胞因子的类型越来越多，我们也要重新考虑样本处理适合自己的样本类型，并且适合自己检测的细胞因子类型，例如，检测因子有可能为蛋白酶3(Protease 3)、核糖核酸酶A(核糖核酸酶A)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE/ELA2)等具有酶活性质的细胞因子，在组织匀浆过程中是否添加蛋白酶抑制剂就值得思考;

　　一些检测细胞因子需要酸化激活处理也需要特别注意，例如转化生长因子-β1(TGF-β1)、肌肉生长抑制素(GDF-8)等，因此在组织匀浆液的pH最好处于6.5-7.5的中性范围;

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