贴壁细胞培养常见问题分析及解决方法!

　　贴壁细胞培养常见问题分析及解决方法!
 

　　贴壁细胞在培养时要贴附于培养(瓶)器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生。贴壁细胞因其培养过程较为繁琐，所以培养时更容易出现问题。BUNSEN本生小编总结了贴壁细胞培养中常见问题，并详细介绍原因和解决方法，若培养时遇到这些情况，可参考对应解决方法处理。

　　一、贴壁细胞培养，细胞不贴壁

　　常见原因：胰蛋白酶消化过度;支原体污染;培养基pH值过碱(NaHCO3分解);细胞老化;接种细胞起始浓度太低或太高。

　　解决方法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度;分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物;使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2;启用新的保种细胞;调节接种细胞浓度。

　　二、培养细胞生长缓慢

　　常见原因：由于更换不同培养液或血清;培养液中一些细胞生长必须成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏;培养物中有少量细菌或真菌污染;试剂保存不当;接种细胞起始浓度太低;细胞已老化;支原体污染。
 

　　解决方法：比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养液;换入新鲜配置培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子;用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物;血清需保存在-10到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清培养液在2-8℃保存，需在1周内用完;增加接种细胞起始浓度;换用新的保种细胞;分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

　　三、细胞生长周期变慢，边养边漂

　　常见原因及解决方法：

　　1、细胞传代时密度太稀或太密：建议细胞密度达80%左右进行传代，传代密度适中，密度过低会延长生长周期;

　　2、传代操作不当：根据细胞特性决定细胞消化时间，一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化，难消化的细胞可分次消化，每次时间不超过5min;频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差，常规换液时间间隔为2~3天。

　　四、传代后部分细胞漂浮

　　常见原因及解决方法：

　　1、传代细胞密度太大：一般细胞汇合度达到80%时可进行传代操作，传代密度需适中，传代密度过高也会导致传代后漂浮;

　　2、细胞状态不好：可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善;

　　3、吹打次数过多造成机械损伤：轻柔吹打，细胞呈单颗粒时可停止吹打，吹打过程避免气泡产生;

　　4、培养基更换后不适应：更换回原来的培养基;或者与原培养基比例混合后使用，使细胞有个适应期。

　　五、传代后细胞全部飘起

　　解决方法：检查所使用的培养基的颜色是否偏紫色，检查瓶盖是否透气，不透气瓶盖是否被拧松。

　　通常培养基偏碱，颜色就会偏紫，主要是因为培养基里的酚红指示剂遇酸变黄、遇碱变紫，培养基量太少，或培养基存放时间太长时都会变碱。建议配好培养基后分装到50mL离心管并于一周内用完，量少时放到15mL离心管里保存。

　　六、传代后细胞成团

　　解决方法：

　　1、低密度接种，延长换液时间，防止细胞脱落;

　　2、使用多聚赖氨酸包被培养器皿，以增加细胞贴壁牢固度，降低细胞聚集成团的几率;

　　3、重新铺板，并更换新配制的培养基，加大血清比例(增加比例不超过5%);

　　4、接种时，减少培养基量(如T25加3mL)以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后(约8-12小时)，再补加培养基到正常用量。

　　七、传代后细胞变形

　　原因及解决方法如下

　　1)变形，但细胞还在生长：可能是血清批次不一样导致，血清成分复杂，不同批次和品牌间均存在成分差异，影响细胞状态。建议使用同一批次血清，更换血清时需与原血清比例混合后使用，使细胞有过渡期;

　　2)变形，但细胞不长，且碎片增多：可能传代操作过程损伤，常见于消化不当，或者潜在支原体等污染导致细胞病态;消化时间根据每个细胞的状态来调整，消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响;培养过程应严格无菌操作，实验环境尽量洁净，确保细胞无外源污染。

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