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BUNSEN本生带你全面了解——ELISA实验的基本知识

更新时间:2023-09-01    点击次数:2460

  BUNSEN本生带你全面了解——ELISA实验的基本知识
 

  基本类型:

  酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) :是酶免疫测定技术中应用的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 )  表面,使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA  法有双抗体夹心法和间接法,者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。BUNSEN本生Elisa试剂盒

  用途:

  根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

  操作程序:

  1、间接ELISA

  本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎(DVH)抗体的ELISA为例,间接ELISA的操作程序如下:

  (1) 材料

  ① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;

  ② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清;待检鸭血清;

  ③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

  (2) 方法步骤

  ① 加抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干

  ③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干

  ④ 加底物液 → 37℃ 30分钟,加终止液

  ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值,并计算出P/N比值。

  (3) 结果判定  已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下,如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待检血清的OD值≥0.4,则判为阳性,否则判为阴性。

  2、双抗体夹心ELISA

  本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。

  ① 加抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干

  ③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干

  ④ 加底物液 → 37℃ 15分钟,加终止液

  ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。

  3、双夹心ELISA

  此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的敏感性。

  此法的基本程序为:

  ① 加抗体(Ab-1)包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 加待检抗原(Ag) → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ④ 加入酶标抗Ab-2抗体(AB-3)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液

  ⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。

  4、竞争ELISA

  此法主要用于测定小分子抗原及半抗原,其原理类似于放射免疫测定。

  其基本程序为:

  ① 抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ③ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液

  ④ 用ELISA检测仪测定OD值。

  被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定,如果待检溶液中抗原越多,被结合的标记抗原的量就越少,有色产物就减少,这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记,而且因为抗原的结构不同,还需应用不同的结合方法。此外,试验中应用酶标抗原的量较多。

  5、阻断ELISA

  本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪狂犬病(PR)及猪胸膜肺炎(AP)的主要检测方法。

  下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序:

  ① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干

  ② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干

  ⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干

  ⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液

  ⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。

  本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

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