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人ELISA试剂盒的正确使用说明讲解

更新时间:2023-11-13    点击次数:656

  人ELISA试剂盒的正确使用说明讲解


  l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人热休克蛋白70(HSP-70)的含量。

  l 有效期:6个月

  l 保存条件:2-8℃

  l 本试剂盒仅供科研使用,不得用于临床诊断

  实验原理

  试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人热休克蛋白70(HSP-70)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人热休克蛋白70(HSP-70)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

  样本处理及要求

  1. 血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

  2. 血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

  3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

  4. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

  注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

  需要而未提供的试剂和器材

  1. 酶标仪(450nm)

  2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

  3. 37℃恒温箱

  4. 蒸馏水或去离子水

  试剂盒组成

  名称96孔配置48孔配置备注

  微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无

  标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无

  样本稀释液6mL3mL无

  检测抗体-HRP10mL5mL无

  20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释

  底物A6mL3mL无

  底物B6mL3mL无

  终止液6mL3mL无

  封板膜2张2张无

  说明书1份1份无

  自封袋1个1个无

  备注:

  1. 标准品浓度依次为:160、80、40、20、10、5 pg/mL

  2. 经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

  注意事项

  1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

  2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

  3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。

  4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。

  5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

  6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

  7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

  8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

  9. 不能使用过期产品。

  10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。

  试剂准备

  试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

  20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

  操作步骤

  1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

  2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

  3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

  4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

  5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

  6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

  7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

  实验结果计算

  以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。

  试剂盒性能:

  1. 检测范围:5 pg/mL – 160 pg/mL。

  2. 灵敏度:检测浓度小于1.0 pg/mL。

  3. 特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

  4. 重复性:板内变异系数小于10% ,板间变异系数小于15% 。

  人Elisa试剂盒本生一直视质量控制为企业的生命,追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承:遵纪守法,严于律己,宽仁以待,敢于承担的企业精神作为标准,以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场,较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢,是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作,共创美好的未来。

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