冰冻切片DAB显色原位杂交实验步骤

　　冰冻切片DAB显色原位杂交实验步骤

　　1.组织固定：组织取出PBS漂洗后立即放入原位杂交固定液(动物)中固定12h以上，4°保存运输。

　　2.脱水：固定后在通风橱内切取目的区域组织块约3mm厚，放入15%蔗糖溶液中8h，后换30%蔗糖溶液中过夜。

　　3.冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，置于原位杂交固定液(动物)固定10min，于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

　　4.修复及消化：根据组织类型，固定时间长短及指标的定位，选用不同的修复液进行修复，具体修复条件见上表。自然冷却后组化笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化，消化时间见上表。纯水冲洗后PBS洗3次，每次5min。

　　5.阻断内源性过氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

　　6.预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

　　7.杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液, 恒温箱杂交过夜。杂交条件见上表。

　　8.杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

　　9.血清封闭：滴加封闭血清正常兔血清 室温孵育30min。

　　10.滴加HRP标记鼠抗digaoxin抗体(anti-DIG-HRP)：倾去血清封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37° 孵育50min，后PBS洗4次×5min。

　　11.DAB显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。

　　12.复染细胞核：苏木素染液复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水洗，苏木素返蓝液返蓝1min，流水冲洗。

　　13.脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，将切片从二甲苯中拿出稍晾干后，封片剂封片。

　　14.显微镜检，图像采集分析。

　　术原理介绍

　　采用digaoxin标记特异性的寡核苷酸序列作为探针。利用HRP(过氧化物酶)标记的抗digaoxin抗体与digaoxin标记的核酸杂交体结合。然后HRP催化DAB(二氨基联苯胺)生成不溶于水的棕黄色产物，实现靶基因-探针杂交体的定位和定量。

　　本产品仅供科研用途，不用于临床诊断!

　　注：以上资料仅供参考!

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