荧光定量PCR耗材常见问题解答

　　荧光定量PCR耗材常见问题解答

以下是荧光定量PCR耗材(八联管、96孔板等)的常见问题及解决方案，综合实验优化与故障排查要点整理：

一、耗材选择问题‌

材质与透明度‌

问题‌：普通PP管导致荧光信号衰减或孔间串扰。

解决‌：优先选用医疗级聚丙烯(PP)材质，透明管(透明度>90%)适配TaqMan探针法，乳白色管可减少SYBR Green法的孔间干扰‌。

管盖设计‌

问题‌：平盖与凸盖适配性差异导致密封不良或蒸发。

解决‌：凸盖适合大体积反应(>50μL)，平盖适配光学检测仪器(如ABI 7500);冻干实验需选双层卡扣密封设计‌。

低体积反应异常‌

问题‌：死体积大导致低浓度样本扩增失败。

解决‌：选用0.1mL矮板或低容管(如384孔板)，减少蒸发并提高热传导效率‌。

二、实验操作问题‌

扩增曲线异常‌

曲线断裂/下滑‌：气泡干扰光路或热盖压力不均。需预离心去气泡，对称放置样本平衡压力‌。

“S”型曲线‌：模板降解或染料失效。建议分装模板避免冻融，更换新鲜荧光染料‌。

重复性差(Ct值波动>0.5)‌

原因‌：加样误差或预混液未混匀。

优化‌：使用多通道移液器，预混液涡旋振荡后分装;定期校准移液枪‌。

熔解曲线多峰‌

非特异性扩增‌：引物二聚体或基因组污染。重新设计引物(GC含量40-60%)，DNase处理模板‌。

三、耗材适配性问题‌

仪器兼容性‌

问题‌：ROX校正染料与仪器不匹配导致基线漂移。

解决‌：选择预混ROX的耗材，或根据仪器要求手动添加‌。

自动化流程故障‌

原因‌：耗材边缘变形导致机械臂抓取失败。

建议‌：使用全裙边96孔板增强稳定性，避免高温长期存储‌。

四、特殊场景优化‌

高通量筛选‌：384孔板需搭配自动化分液系统，注意孔间温控均一性(±0.1℃)‌。

低温实验‌：凸盖管防冻裂，预冷耗材避免热应力损伤‌。

通过匹配耗材特性与实验需求，可显著提升数据可靠性。若问题持续，建议验证引物效率或更换批次耗材‌。

注：以上资料仅供参考，如需更详细操作视频或技术指导，建议联系供应商货实验老师获取‌。

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