ELISA试剂盒实验操作分析汇总

　　ELISA试剂盒实验操作分析汇总

　　ELISA试剂盒实验操作全流程可分为试剂准备、样本处理、包被封闭、反应孵育、洗涤显色、结果判读六大核心步骤‌，结合不同实验方法的差异，具体操作和注意事项如下，可参考：

　　一、前期准备：试剂与耗材预处理

　　试剂盒提前20分钟从冰箱取出，平衡至室温(18-25℃)，仅取出本次实验所需的酶标板条，剩余密封保存避免受潮。

　　浓缩洗涤液用超纯水按比例稀释(一般为25倍稀释)，若有晶体析出可40℃水浴助溶，配置好的洗液建议当天使用。

　　标准品按照试剂盒说明书梯度稀释，现配现用：已溶解的标准品建议12小时内使用，稀释好的梯度工作液建议2小时内使用。

　　生物素标记抗体、酶结合物工作液建议实验前30分钟现配，不适合长期存放。

　　二、样本处理

　　不同类型样本处理方法不同，是去除杂质避免干扰：

　　血清——室温静置30分钟后，1000g离心15分钟，取上清立即检测 不检测需分装冻存于≤-20℃，避免反复冻融

　　血浆——EDTA/肝素抗凝，采集后30分钟内1000g离心15分钟，取上清立即检测 同血清保存要求

　　细胞培养上清——离心去除细胞碎片，若培养基含高浓度BSA需按要求稀释后检测 不检测需分装冻存

　　三、实验操作

　　ELISA常见方法分为直接法、间接法、夹心法、竞争法，操作核心流程一致，仅包被和结合顺序有差异：

　　包被‌：将抗原或抗体溶于缓冲液，加入本生酶标板孔，4℃静置过夜(常用聚苯乙烯96孔板作为固相载体)。

　　封闭‌：包被后用1%~5%脱脂奶粉或BSA溶液再次孵育，覆盖未结合的固相载体表面，降低非特异性显色导致的背景偏高。

　　加样孵育‌：加入待测样本和酶标记试剂，37℃水浴或孵育箱孵育30~60分钟，保证抗原抗体充分结合。

　　洗板‌：孵育后用洗涤液洗板3~5次，拍干去除未结合的游离反应物，保证结果特异性。

　　显色与终止‌：加入底物溶液(常用TMB)，避光孵育显色，达到预期颜色深度后加入终止液(一般为硫酸)终止反应。

　　结果检测‌：用全波长多功能读数仪测定各孔吸光度(OD值)，根据标准曲线计算样本中待测物浓度。

　　四、常见问题及解决方案

　　初学者操作容易出现异常结果，常见问题处理如下：

　　白板(无显色信号)‌：大概率是试剂过期、酶标记物失活、洗涤液未按比例稀释，需检查试剂保质期和配置比例，更换失效试剂。

　　花板(无梯度背景高)‌：多因TMB底物未避光保存提前变蓝、孵育温度过高导致非特异性吸附，需更换底物、控制孵育温度和时间。

　　显色浅灵敏度低‌：常见原因是洗板次数过多、洗涤冲击力过大、显色时间不足，调整洗板参数、延长显色时间即可改善。

　　注：以上科研产品资料供参考，具体可咨询技术老师!

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