elisa的原理、试剂和操作?

　　elisa的原理、试剂和操作?

　　以下是关于‌ELISA(酶联免疫吸附测定)‌的原理、试剂及操作流程的详细解析，本生综合了高可信度来源的核心信息：

　　一、ELISA原理‌

　　ELISA基于抗原-抗体特异性结合反应，通过酶标记放大信号实现检测，其核心步骤包括：

　　固相化‌：抗原或抗体吸附于固相载体(如96孔板)表面，保持免疫活性‌。

　　反应与洗涤‌：待测样本与固相抗原/抗体结合，洗涤去除未结合物质‌。

　　酶标记检测‌：加入酶标抗体(或二抗)，催化底物显色，颜色深浅与目标物浓度成正比‌。

　　技术优势‌：灵敏度高(可达pg/mL级)、操作标准化，适用于临床诊断和科研‌。

　　二、ELISA试剂组成‌

　　核心试剂‌：

　　固相载体‌：聚苯乙烯微孔板(高吸附性)‌。

　　包被抗体/抗原‌：用于捕获目标分子(如夹心ELISA需捕获抗体和检测抗体)‌。

　　酶标记物‌：HRP(辣根过氧化物酶)或AP(碱性磷酸酶)标记的二抗/抗原‌。

　　底物系统‌：TMB(显色底物)或pNPP，终止液(如2M硫酸)‌。

　　辅助试剂‌：

　　封闭液‌：5% BSA或脱脂奶粉，减少非特异性结合‌。

　　洗涤液‌：PBST(含Tween-20的PBS)‌。

　　三、ELISA操作流程(以夹心法为例)‌

　　包被‌：将捕获抗体加入孔板，4℃过夜或37℃孵育2小时‌。

　　封闭‌：加入封闭液(如BSA)，室温孵育1-2小时‌。

　　加样与孵育‌：加入待测样本，37℃孵育1小时‌。

　　检测抗体‌：加入酶标二抗，孵育后洗涤‌。

　　显色与终止‌：加入TMB底物，反应10-30分钟后加终止液‌。

　　读数‌：酶标仪450nm测吸光度，计算浓度‌。

　　关键注意事项‌：

　　洗板需（3-5次），避免残留干扰‌。

　　封板膜一次性使用，防止交叉污染‌。

　　四、ELISA类型与适用场景‌

　　类型‌ ‌原理特点‌ ‌典型应用‌

　　直接ELISA‌ 酶标一抗直接检测抗原 病毒颗粒检测(如HPV)‌

　　间接ELISA‌ 酶标二抗放大信号 抗体筛查(如HIV)‌

　　夹心ELISA‌ 双抗体夹心，灵敏度高 细胞因子(如IL-6)检测‌

　　竞争ELISA‌ 标记抗原与样本抗原竞争结合抗体 小分子检测(如激素)‌

　　五、常见问题与优化‌

　　钩状效应‌：高浓度样本导致假阴性，需稀释后复测‌。

　　灵敏度提升‌：优化抗体亲和力或使用信号放大系统(如生物素-链霉亲和素)‌。

　　注：仅供科研使用，以上资料供参考，如需具体产品说明请咨询技术老师或品牌供应商。

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